Colloque

Caractérisation cinétique de la 2,3-dihydroxybiphényle dioxygénase, une enzyme clé dans la biodégradation des BPC

Frédéric H. Vaillancourt

Lindsay D. Eltis

Membre a labase

Frédéric H. Vaillancourt

Résumé du colloque

La 2,3-dihydroxybiphényle 1,2-dioxygénase (DHBD) est impliquée dans la dégradation microbienne du biphényle et de certains BPC. Cette enzyme est une extradiol dioxygénase typique qui contient un atome de fer ferreux dans son site actif. La DHBD catalyse le clivage du 2,3-dihydroxybiphényle (DHB) en y incorporant de l'O2. La DHBD fut purifiée en anaérobie pour conserver l'atome de fer du site actif à l'état réduit. L'activité spécifique de la préparation obtenue est de 430 U/mg, ce qui est 4 fois plus élevée que ce qui fut rapportée jusqu'à maintenant. Le mécanisme de l'enzyme est de type 'complexe ternaire d'ordre obligatoire', le substrat catécholique se liant au fer d'abord, suivit par l'oxygène. Des études cinétiques de type 'steady-state'ont été effectuées pour différents substrats de l'enzyme dont l'oxygène. Par exemple, la spécificité de cette enzyme pour le DHB est 115 fois plus grande que celle pour le 3-méthylcatéchol et 380 fois plus grande que celle pour le catéchol. Le t-butanol, comme d'autres solvants organiques, inhibe et stabilise les extradiol dioxygénases. Le t-butanol inhibe le clivage du DHB de façon mixte; l'inhibition compétitive (Kic = 700 ± 100 mM) étant plus importante que l'inhibition incompétitive (Kiu = 1400 ± 120 mM). Ce résultat implique que le t-butanol se lie au site actif de la DHBD en présence et en absence du substrat catécholique. Ceci concorde avec les données cristallographiques de la DHBD (collaboration avec le Dr J.T. Bolin, Purdue University, IN, USA). Basé sur les données cristallographiques ainsi que sur des alignements de séquence, des résidus furent ciblés par mutagénèse dirigée pour élucider les déterminants de la spécificité de la DHBD pour les substrats bicycliques. L'effet de la substitution respective des résidus V148, Met175, Ala200 et Pro 280 fut élucidé par les études cinétiques.