Colloque

Caractéristiques et activation d'origines de réplication chez les cellules mammifères

Maria Zannis-Hadjopoulos

R. Pelletier

D. Matheos

M. T. Ruiz

A. Todd

T. O. Neilsen

G. P. Price

Membre a labase

Maria Zannis-Hadjopoulos

Résumé du colloque

Les travaux de notre laboratoire portent sur l'identification des origines de la réplication de l'ADN ainsi que des facteurs cellulaires qui contrôlent leurs activités. Nous avons utilisé plusieurs méthodes différentes pour isoler des origines de la réplication actives de mammifères (chez le singe et l'humain). La détermination de la fonction de ces origines putatives est effectuée par certains tests de réplication dont le test in vivo de la réplication autonome transitoire, le test de persistance à long terme des origines en tant qu'épisomes dans des cellules de mammifères, le test de réplication in vitro, l'examen au microscope électronique de l'ADN en réplication et la détermination de leur activité in vivo par PCR. Le site d'initiation reste le même, indépendamment de la méthode utilisée et se localise toujours dans la même région de l'ADN examinée. Une analyse par délétion a démontré qu'un fragment de 186 paires de bases provenant de ors8, une séquence de réplication autonome de mammifères isolée par l'extension de l'ADN naissant de singe au début de la phase S, représente la séquence minimale nécessaire à la fonction de cette origine in vivo et in vitro. Ce fragment contient plusieurs patrons de séquence répétés, une séquence inversée répétée imparfaite de 44 paires de bases et un élément liant consensus imparfait pour le facteur de transcription Oct-1. L'ajout d'un oligonucléotide contenant le site liant de Oct-1 à la réaction de réplication de p186 in vitro inhibe sa réplication. Nous avons utilisé le sous-fragment de 186 paires de bases de ors8 afin d'identifier d'autres protéines cellulaires qui interagissent avec cette séquence de façon spécifique. Nous avons entamé la purification, à partir d'extraits de cellules HeLa, de protéines ayant une activité liante à ors (OBA). Nous avons séparé une fraction, partiellement purifiée, démontrant une activité OBA. Cette fraction comprend deux bandes évidentes de protéines mesurant 146 kDa et 154 kDa. Elle co-purifie avec la protéine de réplication A (RP-A), les polymérases a et d ainsi que la topoisomérase II. Les résultats d'expériences de compétition avec des sous-fragments de la séquence de 186 paires de bases, ont permis d'identifier une région de 59 paires de bases représentant le site de liaison. La liaison au niveau de cette région a été confirmée par empreinte (footprinting) à la ADNase 1.

Contexte

Section :

Mécanismes de la replication, réparation et recombinaison de l'ADN chez les cellules mammifères

Thème du colloque :

Mécanismes de la replication, réparation et recombinaison de l'ADN chez les cellules mammifères

Hôte : Université McGill

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