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Clonage et séquençage du gène dacA codant pour la PLP5 chez le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa PAO1

Luc A. Gagnon
Robert W. Hancock
Ann Huletsky
LA

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Luc A. Gagnon

Résumé du colloque

Les protéines liant la pénicilline (PLPs) qui sont impliquées dans la biosynthèse du peptidoglycane sont les cibles des antibiotiques de type ß-lactamine. Chez le microorganisme Pseudomonas aeruginosa, sept PLPs ont été détectées (PLP1A, 1B, 2, 3, 4, 5 et 6). Des études antérieures ont clairement démontré que les PLPs de haut poids moléculaire (PLP1A, 1B, 2 et 3) sont essentielles à la survie de la bactérie alors que les PLPs de faible poids moléculaire semblent secondaires. La PLP5 qui agit principalement lors de la maturation du peptidoglycane comme D-alanine carboxypeptidase démontre également une activité ß-lactamase. Afin de mieux comprendre le mécanisme d'action de cette enzyme, nous avons isolé et caractérisé le gène codant pour cette protéine. Afin d'isoler le gène dacA codant pour la PLP5, deux amorces dégénérées selon la fréquence d'utilisation des codons chez P. aeruginosa ont été conçues à l'aide de la séquence peptidique de l'extrémité N-terminale de la PLP5 de P. aeruginosa et d'une région conservée [DGL(I)KTG] retrouvée chez les PLP5 d'Escherichia coli, Bacillus stearothermophilus et Bacillus subtilis. Ces amorces ont été utilisées afin d'amplifier un amplicon de 612 pb correspondant à l'extrémité N-terminale de la PLP5 de P. aeruginosa. Cet amplicon a été utilisé afin de cribler une banque d'ADN génomique de P. aeruginosa PAO1 construite dans le phage lambda-ZAP EXPRESS. Un clone positif a été retenu et un fragment SacI-BamHI de 2,4 kb a été sous-cloné dans le vecteur pBGS19+. L'analyse de la séquence du fragment sous-cloné a révélé la présence de deux autres cadres de lecture bordant le gène dacA. Tout d'abord, on retrouve en amont du gène dacA le gène rlpA et en aval, l'extrémité N-terminale du gène lipB. La même organisation génique est retrouvée chez E. coli et H. influenzae. La séquence peptidique du gène dacA a révélé un pourcentage d'homologie de près de 66%, 62%, 58% et 57% avec la séquence peptidique des gènes dacA d'E. coli, H. influenzae, B. stearothermophilus et B. subtilis respectivement. De plus, l'alignement et l'analyse de la séquence peptidique a permis de démontrer la présence de trois motifs essentiels retrouvés chez les PLPs (SXXK, SXN et KT(S)G). Des études ont été entreprises afin de surexprimer et de purifier la PLP5.

Contexte

Section :
Biologie cellulaire et moléculaire
news icon Thème du colloque :
Biologie cellulaire et moléculaire
host icon Hôte : Université de Trois-Rivières

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Titre du colloque :

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