Colloque

Démonstration de la fonction in vivo d'une origine de réplication de l'ADN de mammifère, ors12, et localisation chromosomique du site d'initiation

Richard Pelletier

Gerald B. Price

Maria Zannis-Hadjopoulos

Membre a labase

Richard Pelletier

Résumé du colloque

Ors12, une origine de réplication de l'ADN précédemment isolée de l'ADN naissant de cellules de singe CV-1, peut se répliquer de façon autonome après transfection dans des cellules HeLa et dans un système in vitro utilisant des extraits de ces mêmes cellules. Elle contient une région a-satellite (~168 nt) ainsi qu'une région non répétitive qui est présente à moins de neuf copies par génome. Ors12 s'associe également à la matrice nucléaire en relation avec le cycle cellulaire. Afin de démontrer que l'initiation de la réplication de l'ADN se situe sur ou près du locus chromosomique de ors12, nous avons généré 5 paires d'amorces PCR (reaction de polymérase en chaine) à partir de la séquence d'un clone génomique CV-1 contenant ors12. Deux de ces amorces se situent en amont de ors12, une est dans ors12 même et les deux autres se situent en aval, dans une region couvrant un total de 8 Kb. Nous avons ensuite isolé l'ADN naissant provenant de cellules CV-1 asynchrones, qui fut ensuite séparé sur un gradient de sucrose. Des fractions contenant des brins d'environ 500 à 800 nt furent retenues et utilisées pour l'amplification par PCR competitif (Giacca et al., 1994, P.N.A.S. 91, 7119-7123) avec les 5 amorces et un competiteur spécifique à chaque segment amplifié. Il nous est donc possible de quantifier précisémment le nombre de brins naissants qui sont synthétisés à partir de l'origine et à chacune des amorces: avec cette stratégie, nous avons démontré qu'environ 66% des brins naissants proviennent de ors12 (dans la région de 8 Kb), confirmant ainsi la fonction d'origine chromosomique de celle-ci. Cependant, environ 23% proviennent d'un segment en amont de ors12, constituant ainsi une autre origine de réplication. Dans le but de déterminer la séquence minimale de ors12 essentielle à son fonctionnement, nous avons construit plusieurs mutants de délétion de celle-ci que nous avons clonés et transfectés dans des cellules Hela pour mesurer leur capacité à se répliquer de façon autonome. Ces résultats seront discutés plus en détail.

Contexte

Section :

Biologie cellulaire et moléculaire

Thème du colloque :

Biologie cellulaire et moléculaire

Hôte : Université McGill

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Titre du colloque :

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