Colloque

Des mutants spontanés de l'échangeur Na/H nous livrent leurs secrets et davantage...

Josette Noel

Nathalia Oulianova

David Germain

Jacques Pouysségur

Julie Vadnais

Membre a labase

Josette Noel

Résumé du colloque

La nature nous a procuré un mutant spontané de l'isoforme 1 des échangeurs Na/H (NHE1) arborant un phénotype de très haute résistance aux inhibiteurs spécifiques des NHEs. Considérant que l'isoforme 1 des échangeurs Na/H (NHE1), très sensible aux inhibiteurs, est exprimée dans presque tous les tissus de mammifères et y joue un rôle dans l'homéostasie du pHi, dans la régulation du volume cellulaire et dans la prolifération cellulaire, nous avions un grand intérêt à caractériser et à identifier la ou les mutations responsable(s) du phénotype de haute résistance de ces cellules. En effet, une activité anormale de cette protéine semble être associée à différentes pathologies dont l'hypertension spontanée et le diabète insulino-dépendant. Utilisant les ARN messagers isolés des cellules mutantes comme matrice d’une RT-PCR, nous avons identifié une seule base mutée dans l'ADNc de NHE1 : l'acide aminé Glu(E) en position 346 (E346) est remplacé dans ce mutant par le résidu Asp(D), E346D, différent de Glu par un seul groupement méthylène. Cette mutation, une fois reproduite dans l'ADNc du NHE1 de type sauvage (NHE1-E346D) et celui-ci exprimé dans des fibroblastes déficients en échangeur Na/H, a induit le même phénotype que le mutant spontané, confirmant ainsi que la mutation E346D était seule responsable du phénotype de très forte résistance à l'amiloride (IC50=400 vs 4 ?M), au MPA (IC50=10 vs 0.05 ?M) et au HOE694 (IC50=300 vs 0.15 ?M) observé pour le mutant spontané de NHE1. En outre, la protéine NHE1-E346D présente une affinité significativement réduite pour le Na (40 mM vs 10 mM) et le Li. Inspirés des résultats de Counillon et al. (PNAS, 90:4508,1993; Biochemistry, 36:2951,1997) et de Wang et al. (AJP, 269:C392,1995) où il a été montré que la mutation unique des résidus Leu163 ou Gly174 du segment M4 et du résidu His349 du segment M9 de NHE1 en Phe, en Ser et en Gly, respectivement, diminuait la sensibilité de ces protéines pour l'amiloride, mais non leur affinité pour le Na, nous avons généré des mutants combinant la mutation E346D avec une, deux ou trois de ces mutations. De façon générale, la plupart de ces mutants présentent une sensibilité aux inhibiteurs et une affinité pour le Na encore plus faible que le mutant E346D. Ces observations suggèrent donc que 1) le site de transport du Na est identique au site d'interaction des inhibiteurs des NHEs et 2) que les segments M4 et M9 de NHE1 participent ensemble à la création d'un site d'interaction avec le Na et les inhibiteurs. Enfin, compte tenu des importantes modifications fonctionnelles apportées par la mutation E346D, nous avons voulu déterminer l'importance de la structure de l'acide aminé en position 346 dans l'interaction de NHE1 avec le Na et dans l'interaction de NHE1 avec les inhibiteurs. Ainsi, des protéines NHE1 dont l'acide aminé E346 a été substitué par des résidus de charge, de taille et de polarité différentes ont été récemment générées, exprimées et analysées. Il s'avère, jusqu’à maintenant, que toute modification effectuée (Gln, Asn, Trp, Ala, Gly) résulte en l'obtention d'une protéine mutée de 15 à 8000 fois plus résistante aux inhibiteurs que la protéine NHE1 de type sauvage. Ces résultats démontrent la très grande importance de l'acide aminé en position 346 dans l’établissement d’une interaction avec les autres acides aminés du même segment transmembranaire (M9) ou d’autres segments (en particulier M4) de la protéine NHE1. De telles informations sont essentielles à la promotion de la synthèse de molécules inhibitrices de plus en plus spécifiques à NHE1 et aux différentes isoformes de l'échangeur Na/H. Les implications médicales de posséder de tels inhibiteurs spécifiques sont réelles à moyen et long terme; par exemple, l'inhibition spécifique de NHE1 dans les tumeurs cancéreuses peut contribuer d'une part à inhiber la prolifération cellulaire désordonnée et pourrait d'autre part, diminuer l'invasion des métastases via un effet inhibiteur sur la motilité cellulaire.

Contexte

Section :

Protéines de transport membranaire à l'échelle moléculaire

Thème du colloque :

Protéines de transport membranaire à l'échelle moléculaire

Hôte : Université de Montréal

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Titre du colloque :

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