Colloque

Effet d'Oct-1 sur la réplication in vitro de p186, une origine de réplication d'ADN de mammifère

Diamanto Matheos

Marcia T. Ruiz

Maria Zannis-Hadjopoulos

Membre a labase

Diamanto Matheos

Résumé du colloque

Auparavant, nous avons démontré, par analyse de délétion, qu'un fragment de 186 paires de bases (pb) de ors8, une séquence d'ADN mammifère isolée par extrusion de l'ADN naissant de singe au début de la phase S, était la séquence minimale requise pour la fonction de l'origine in vivo et in vitro. p186 contient une répétition inverse imparfaite de 44 pb, un site de liaison imparfait pour le facteur de transcription Oct-1, et plusieurs sites de liaisons pour le facteur de transcription particulier aux erythroïdes, GATA-1. Les sites de liaison des facteurs de transcription servent comme des constituants auxiliaires qui agissent en cis et qui rehaussent l'activité de l'origine de réplication. Dans le but d'acquérir une meilleure compréhension de l'interaction des facteurs cellulaires qui régulent l'activité de l'origine et des mécanismes d'initiation de la réplication mammifère d'ADN, nous avons entrepris de déterminer le rôle d'Oct-1 dans la réplication in vitro de p186, en utilisant des extraits de cellules HeLa. Premièrement, une liaison spécifique du domaine POU d'Oct-1 au fragment de 186 pb a été confirmée par retardation en gel. Ensuite, l'épuisement de la protéine Oct-1 de nos extraits par inclusion d'un oligonucléotide comprenant le site de liaison d'Oct-1 a inhibé la réplication de p186 à 15-20% du contrôle, tandis qu'un oligonucléotide non-spécifique à Oct-1 n'avait aucun effet. Cette inhibition a été partiellement inversée par l'addition du domaine POU d'Oct-1 qui fait concurrence avec la protéine endogène Oct-1 pour la liaison à l'oligonucléotide. Par analyse Western, nous avons remarqué qu'Oct-1 est présente seulement dans nos extraits nucléaires et non cytoplasmiques, en accord avec le fait qu'Oct-1 est une protéine nucléaire. L'addition de la protéine purifiée Oct-1 a rehaussé la réplication in vitro de p186 de 2-3 fois lors de l'utilisation d'extraits cytoplasmiques. Aucun effet n'a été observé lorsque les extraits nucléaires étaient utilisés seuls ou en conjonction avec les extraits cytoplasmiques. Nos résultats indiquent que le facteur de transcription Oct-1 est un facteur stimulateur dans la réplication in vitro du plasmide contenant le fragment de 186 pb de ors8. Des mécanismes par lesquels Oct-1 exerce sa fonction seront discutés.

Contexte

Section :

Biologie cellulaire et moléculaire

Thème du colloque :

Biologie cellulaire et moléculaire

Hôte : Université McGill

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Titre du colloque :

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