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Étude de la reconnaissance spécifique du glutamate par la glutamyl-tRNA synthétase d'Escherichia coli

Daniel Dubois
Shigeyuki Yokoyama
Jacques Lapointe
Yutaka Muto
Lucille Lacoste
DD

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Daniel Dubois

Résumé du colloque

Les aminoacyl-tRNA synthétases (aaRS) catalysent, en présence d’ATP, le chargement spécifique d’un acide aminé (une enzyme par acide aminé, normalement) à l’adénosine terminale du ou des tRNAs correspondants. La spécificité de cette réaction est largement responsable de la fidélité de la traduction de l’information génétique en protéines. La glutamyl-tRNA synthétase (GluRS) doit donc reconnaitre ses substrats (tRNAGlu, glutamate et ATP) et les discerner efficacement de molécules semblables. La discrimination entre le glutamate et la glutamine est particulièrement critique car non seulement les deux molécules ont des structures similaires (groupement carboxylate vs carboxyamide à l’extrémité de la chaîne latérale) mais aussi les enzymes chargées de leur aminoacylation sur leur tRNA respectif (GluRS et GlnRS) sont étroitement apparentées évolutivement, les GlnRS provenant de l’évolution d’une GluRS eukaryotique ancestrale. Cette relation étroite entre les GluRS et les GlnRS nous a permis, par alignement de leur séquence en acides aminés, d’identifier six mutations ponctuelles (T12N, L66F, R199C, Q210Y, Y224Q, H226E, chez la GluRS de E. coli) qui pourraient lui permettre de reconnaître la glutamine plutôt que le glutamate. Les mutations proposées, seules et en combinaison, furent donc réalisées chez la GluRS de E. coli et les enzymes mutantes, après purification à homogénéité à l’aide d’un His-Tag sur colonne de Ni-NTA, seront étudiées pour leur capacité à lier, activer et aminoacyler le glutamate et/ou la glutamine. Pour faciliter l’interprétation structurale des résultats de mutagénèse, la modélisation du glutamate dans le site actif fut entreprise sur la base de la structure tridimensionnelle de la GluRS de T. thermophilus. Pour appuyer notre démarche, la conformation du glutamate liée à la GluRS de E. coli fut étudiée par RMN (technique par Transfert de l’Effet Nucléaire Overhauser, TRNOE) en présence et en absence du tRNAGlu. La compétition effective avec un inhibiteur spécifique de la GluRS, le glutamol-AMP, a confirmé la spécificité de la liaison observée en RMN. La structure obtenue du glutamate permet de mieux comprendre les interactions entre l’enzyme et son substrat et d’affiner notre modèle structural. Sur la base de ce dernier, la plupart des positions mises en évidence par les alignements de séquences seraient en mesure de jouer un rôle direct dans la reconnaissance du glutamate, alors que pour d’autres (T12 et L66) ce rôle serait indirect et/ou relié à la stabilisation de l’intermédiaire de la réaction.

Contexte

Section :
Biochimie et biologie structurale
news icon Thème du colloque :
Biochimie et biologie structurale
manager icon Responsables :
Michel Guertin
host icon Hôte : Université Laval

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Titre du colloque :

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