Colloque

Étude de la régulation traductionnelle des gènes cysE et cysS de Bacillus subtilis

Philippe Garneau

Jacques Lapointe

Membre a labase

Philippe Garneau

Résumé du colloque

Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) sont des enzymes ubiquitaires chargeant de manière spécifique les ARNs de transfert avec l'acide aminé qui leur est propre, réalisant ainsi une étape préliminaire essentielle de la biosynthèse des protéines. À ce jour, la plupart des gènes codant pour les aaRS de la bactérie Bacillus subtilis ont été clonés, séquencés et situés sur le chromosome. Les gènes gltX et cysS de cet organisme, codant respectivement pour la glutamyl-ARNt synthétase (GluRS) et la cystéinyl-ARNt synthétase (CysRS) sont exprimés à partir d'un même opéron qui contient aussi, en aval de gltX et en amont de cysS le gène cysE, qui correspond à la sérine acétyltransférase (SAT), la première enzyme de la voie de biosynthèse de la cystéine. Cet opéron est le premier cas publié où deux gènes codant pour des aaRS sont co-transcrits; il est aussi le premier cas connu d'un gène d'aminoacyl-ARNt synthétase co-transcrit avec le gène d’une enzyme de biosynthèse de l'acide aminé qui est son substrat. La régulation transcriptionnelle de cet opéron, présentement étudiée dans le laboratoire du Dr. Lapointe, viendrait supporter le modèle de l'antitermination de la transcription qui est réalisée à partir d'une région terminateur-antiterminateur entre les gènes gltX et cysE et dont le modulateur est l'ARNtcys non chargé. Toutefois, cette forme de régulation ne permet pas d’expliquer les raisons de la co-transcription de cysE et cysS, ce qui est une situation différente de celle observée chez E. coli où cysE est exprimé de manière constitutive. L'assimilation de l'ion sulfate, la source majeure de soufre chez les prokaryotes, passe obligatoirement par sa réduction et son incorporation dans la cystéine. Cet élément, bien que mineur, est essentiel à la survie de la bactérie, et est utilisé dans les protéines sous forme de cystéine et de méthionine. En passant par la cystéine, le soufre est également incorporé dans plusieurs cofacteurs, dont l’acétyl-CoA. La régulation de l'assimilation du sulfate et de la biosynthèse de la cystéine est bien connue chez Escherichia coli, mais n'a encore été que très peu étudiée chez Bacillus subtilis. Il est possible que l’opéron gltX-cysE-cysS de cette bactérie ait un rôle à jouer dans cette régulation. Le but de mes recherches à la maîtrise consiste à analyser la régulation traductionelle des gènes cysE et cysS. Plusieurs éléments dans la structure de l'opéron semblent indiquer que celle-ci pourrait être modulée à des niveaux multiples tels que la demi-vie de l'ARNm, l’initiation de la traduction, et au cours de la traduction comme telle. L'étape préliminaire à une telle étude consiste à mesurer les niveaux de traduction de ces deux gènes dans différentes conditions de croissance. Les taux de traduction seront déterminés en mesurant le niveau des produits de cysE et de cysS à l’aide d'anticorps qui leur sont spécifiques. La demi-vie de l’ARNm cysE-cysS sera déterminé par essais à la nucléase S1 d’ARNm prélevé à différents temps suivant l’addition de rifampicine à une culture de B. subtilis sauvage en présence ou non de L-sérine ou de cystine. La surproduction ainsi que la purification de la CysRS de Bacillus subtilis est réalisée en vue d’obtenir des anticorps spécifiques. Une surproduction d'environ 300 fois de la CysRS a été réalisée chez Escherichia coli DH5alpha(pYG209) après induction à l'IPTG. La purification de cette enzyme est en cours. Le clonage, la surproduction et la purification de la sérine acétyltransférase (SAT) est également prévue avec pour objectif d'obtenir également des anticorps. Le gène cysE sera introduit dans un vecteur pET de manière à ajouter à son produit une queue de polyhistidine à l'extrémité N-terminale. La protéine recombinante produite sera purifiée selon la méthode standard de chromatographie d'affinité à l'aide d'une colonne NTA Superflow Agarose de QIAGen. La queue de polyhistidine sera éliminée et la SAT purifiée sera utilisée pour produire des anticorps spécifiques. Les anticorps anti-CysRS et anti-SAT produits permettront de doser les niveaux des deux enzymes correspondantes en présence et en absence de cystine, de L-sérine et de L-méthionine, ce qui pourrait démontrer l'existence d'un mécanisme de régulation traductionnel ainsi que sa fonction.