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Expression et purification des petites protéines G, RhoA et Cdc42 chez Saccharomyces cerevisiae

Quynh-Tran Nguyen
Richard Beliveau
Quynh-Tran Nguyen
QN

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Quynh-Tran Nguyen

Résumé du colloque

Les petites protéines G de la famille Rho, qui comprend notamment RhoA et Cdc42, sont impliquées dans l’organisation du cytosquelette et dans des phénomènes reliés à la cancérisation. Elles présentent un motif structural conservé CXXX en position C-terminale subissant trois modifications post-traductionnelles: isoprénylation de la cystéine, protéolyse des trois derniers acides aminés et méthylation du groupement carboxyle de la cystéine C-terminale. Le modèle d’expression de protéines eucaryotes chez Escherichia coli ne permet pas d’obtenir des protéines Rho prénylées. Nous avons élaboré un système d’expression des protéines Rho recombinantes dans un vecteur d’expression eucaryote permettant la production de protéines de fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) chez S. cerevisiae. Les levures ont été transformées avec les vecteurs pYEX-4T RhoA/Cdc42 puis sélectionnées en milieu minimal sans uracil. Les levures sont traitées à la zymolyase afin d’obtenir des sphéroplastes qui sont soumis à une cavitation gazeuse. Les membranes de S. cerevisiae obtenues contiennent RhoA et Cdc42 prénylées. L’ajout de RhoGDI, une protéine régulatrice des Rho liant sélectivement RhoA et Cdc42 prénylées, permet d’extraire ces protéines des membranes. Les protéines de fusion sont purifiées par colonne glutathion-sépharose et les complexes RhoGDI/petite G sont brisés par l’ajout de CHAPS. Ceci permettra l’analyse des cinétiques d’interaction de RhoA et Cdc42 avec leurs régulateurs sur BIAcore, un appareil utilisant la résonance de plasma de surface.

Contexte

Section :
Biochimie et biologie structurale
news icon Thème du colloque :
Biochimie et biologie structurale
manager icon Responsables :
Michel Guertin
host icon Hôte : Université Laval

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Titre du colloque :

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