Colloque

Expression et purification d'une molécule présentant une action anti-angiogénique, le fragment K5 du plasminogène

Quynh-Tran Nguyen

Membre a labase

Quynh-Tran Nguyen

Résumé du colloque

L’angiogénèse désigne la formation de nouveaux capillaires sanguins par l’excroissance ou le bourgeonnement de vaisseaux préexistants. Il s’agit d’un processus essentiel à la croissance agressive des masses tumorales et à la dissémination et à la croissance de leurs métastases. L’apparition du phénotype angiogénique dépend de la balance entre les concentrations d’effecteurs et d’inhibiteurs du phénomène. La protéine K5 est un fragment protéolytique du plasminogène dont l’action inhibitrice a été démontrée tant au niveau de la prolifération des cellules endothéliales que de leur migration. L’ADNc codant pour le K5 de souris a été amplifié par PCR et inséré dans un vecteur d’expression pET22b(+) sous le contrôle du promoteur du phage T7 et inductible par l’IPTG. La séquence nucléotidique du K5 recombinant a été pourvue d’une séquence codant pour un signal d’exportation entrainant la sécrétion de la protéine dans l’espace périplasmique en N-terminal ainsi que d’une séquence codant pour un hexamère d’histidines en C-terminal (His-tag). Les rendements faibles ont nécessité l’optimisation de l’expression en variant le milieu, les conditions de cultures, les concentrations d’IPTG et le temps d’induction. Nous avons purifié le rK5 exprimé chez E. coli BL21 par chromatographie d’affinité en utilisant une résine Ni-NTA-agarose. La protéine a pu être purifiée jusqu’à quasi homogénéité sous forme native via une procédure de choc osmotique partiel suivie d’une chromatographie d’affinité sur colonne de Ni-NTA. Le lavage des contaminants a été effectué en utilisant un gradient de pH et l’élution du rK5 avec une solution d’imidazole. La protéine purifiée a été utilisée pour immuniser des lapins dans le but d’obtenir des anticorps polyclonaux afin de détecter la présence de K5 dans les tissus tumoraux. De plus, l’obtention de K5 constitue une étape cruciale pour tenter d’isoler les molécules interagissant avec lui au niveau des cellules endothéliales en culture par co-immunoprécipitation et de caractériser ses effets sur la cascade de signalisation induite par les facteurs de croissance sur les cellules endothéliales.

Contexte

Section :

Cancérologie

Thème du colloque :

Cancérologie

Hôte : Université d’Ottawa

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