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La construction d'un chromosome artificiel de première génération chez les mammifères

Nandini Cossons
Gerald B. Price
Maria Zannis-Hadjopoulos
Torsten O. Nielsen
NC

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Nandini Cossons

Résumé du colloque

Un chromosome artificiel chez les mammifères a besoin de trois éléments génétiques qui agissent en cis: une origine de réplication de l'ADN, un centromère et des télomères. Le plasmide pYACneo de 15.8 kb contient les éléments de levure ARS, CEN et TEL, ainsi que les marqueurs de résistance d'ampicilline et de néomycine. À partir de ce plasmide, trois origines mammifères de réplication de l'ADN ont été clonées séparément dans le site EcoRI: 343, une origine du chromosome 6q; X24, un élément génétique qui inclus la zone d'initiation de réplication de DHFR chez les hamsters; et S3, une séquence qui peut se répliquer de façon autonome. Quand ces constructions circulaires ont été transfectées dans les cellules HeLa et sélectionnées avec le marqueur de néomycine, l'efficacité de transfection stable a augmenté de deux fois alors que ces séquences d'origine de réplication étaient présentes, par comparaison au vecteur seul. Après >45 générations avec sélection, les transfectants ont été vérifiés pour la présence de l'ADN épisomal ou intégré et ce, en utilisant un essai de fluctuation, d'amplification par PCR ou d'analyse par FISH. Bien que la majorité des transfectants ait montré l'intégration des constructions dans le génome de l'hôte, plusieurs transfectants résistants au G418 ont été isolés et ceux-ci étaient capables de maintenir les constructions circulaires dans un état épisomal. Aussitôt que les constructions ont été linéarisées, tous les transfectants ont été intégrés dans le génome, ce qui confirme que les télomères de Tetrahymena, qui sont présents dans le pYACneo, ne fonctionnent pas dans les cellules humaines. Dans la prochaine étape de la construction d'un chromosome artificiel de mammifères, les séquences humaines du télomère (TTAGGG) ont déjà été clonées dans les constructions ci-haut mentionnées et seront prochainement vérifiées pour leur stabilité comme éléments extra-chromosomiques.

Contexte

Section :
Biologie cellulaire et moléculaire
news icon Thème du colloque :
Biologie cellulaire et moléculaire
host icon Hôte : Université McGill

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Titre du colloque :

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