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Nouvelle approche d’identification de gènes essentiels in vivo en maladie infectieuse

Dario Lehoux
Guy Cardinal
Roger C. Levesque
François Sanschagrin
DL

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Dario Lehoux

Résumé du colloque

Pseudomonas aeruginosa (PA) est un pathogène opportuniste causant des infections secondaires graves chez les personnes atteintes de mucoviscidose. Plusieurs facteurs de virulence de PA ont été identifiés, mais leur importance respective dans le mécanisme d’initiation et/ou de maintien de l’infection n’a pas été démontrée. Nous avons développé une nouvelle méthode permettant d’identifier des gènes essentiels à l’initiation et/ou au maintien de l’infection par PA. Cette méthode découle de la mutagénèse avec étiquettes uniques ("signature tagged mutagenesis" (STM)) où l’identification de gènes essentiels in vivo se fait par sélection phénotypique négative. C’est une méthode qui comporte plusieurs avantages. Entre autres, elle permet de cibler plusieurs gènes essentiels en un seul essai. De plus, elle utilise des étiquettes d’ADN bien définies, ce qui permet d’utiliser la sensibilité et la spécificité du PCR. Cette approche demande la construction de banques de mutants à l’aide du mini-transposon mini-Tn5 Km2. Ce mini transposon est constitué d’une cassette contenant le gène de résistance à la kanamycine et d’une étiquette d’ADN bien définie. Cette étiquette d’ADN comprend une région invariable en 5’ permettant une amplification maximale par PCR, et une région variable en 3’ permettant une amplification par PCR spécifique. Nous avons donc synthétisé et cloné 11 oligonucléotides différents pour former 11 mini-Tn5 à étiquettes uniques. Ces mini transposons ont été transférés dans PA par conjugaison à l’aide de la souche conjugative E. coli S17-1lambdapir, ce qui nous a permis de construire 11 banques de mutants de PA. Des analyses par PCR sur colonies ont montré qu’au moins 80% des colonies obtenues étaient des transconjugants possédant le mini-Tn5 avec son étiquette d’ADN. Nous avons démontré par hybridation que le mini-Tn5 s’insère aléatoirement sans préférence dans le génome de PA. Par la suite, les mutants obtenus subissent une sélection phénotypique in vivo, ce qui permet d’identifier les mutants ayant un gène essentiel in vivo non-fonctionnel. Cette nouvelle technique nous a donc permis d’identifier des gènes essentiels à l’initiation et/ou au maintien de l’infection causée chez PA.

Contexte

Section :
Biologie et génétique moléculaires
news icon Thème du colloque :
Biologie et génétique moléculaires
manager icon Responsables :
Louis Bernatchez
host icon Hôte : Université Laval

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Titre du colloque :

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