Colloque

Régulation de l'activité des canaux potassiques des cellules endothéliales aortiques par réactions d'oxydoréduction. Rôles des résidus cystéine

Rémy Sauvé

Hélène Klein

Line Garneau

Fadi Hobeila

Catherine Hamer-Lavoie

Membre a labase

Rémy Sauvé

Résumé du colloque

Les groupements cystéine jouent un rôle clef dans la stabilisation de la structure tertiaire des protéines tout en constituant des sites potentiels de régulation de l'activité protéique par réactions d’oxydoréduction. Nos travaux antérieurs sur les cellules endothéliales d’aortes de bovins ont mené à l’identification de deux canaux potassiques dont l’activité s'est avérée particulièrement sensible à la présence d'agents oxydants. Ainsi, une inhibition de l'activité d'un canal potassique activé par le calcium de conductance intermédiaire (IKCa) fut observée suite à l’application interne de DTNB, de thimérosal ou de peroxyde. L'ajout de ces agents au milieu externe est demeuré toutefois sans effet, ce qui suggère une plus grande accessibilité des sites d'oxydoréduction du côté cytosolique. Par ailleurs, des expériences similaires effectuées sur un canal à rectification entrante de type IRK1, ont montré une insensibilité du canal au DTNB mais un effet inhibiteur marqué en présence de peroxyde, de thimérosal ou de MTSEA du côté interne. Suite au clonage dans nos laboratoires de canaux IKCa et IRK1 à partir de cellules endothéliales de veines ombilicales humaines, une étude fut entreprise afin de déterminer 1) la nature des sites responsables de la régulation par réactions d'oxydoréduction des canaux IKCa et IRK1 dans les cellules endothéliales et 2) la contribution des groupements cystéine aux propriétés de conduction et d’activation de ces canaux. L’approche expérimentale choisie a consisté à muter en sérine chacun des 13 résidus cystéine de IRK1, de même que chacun des quatre groupements cystéine de IKCa localisés dans le segment S6. Les canaux mutés furent par la suite exprimés dans des œufs de Xénopus laevis pour étude sur canaux unitaires par la méthode de patch clamp en configuration patch excisé. Nos travaux sur IRK1 montrent que les cystéines en position 89 et 149 influencent la conductance du canal alors que des variations importantes dans les propriétés cinétiques du canal sont observées suite aux mutations C76S et C311S. Ainsi, la mutation C76S mène à la fermeture quasi permanente du canal sans modification de la conductance. Par contre, le mutant C89S montre une conductance unitaire diminuée de 30 %. Avec une cinétique de type sauvage caractérisée par l'apparition de longues ouvertures. Aucune de ces mutations n’a pu conférer au canal une insensibilité au thimérosal. De façon similaire, la mutation C277S dans IKCa a provoqué un changement de la cinétique du canal caractérisé par une augmentation de la fréquence des fermetures. Une augmentation de la conductance de 15 % fut aussi observée suite à la mutation cystéine-> sérine en position 269. Toutefois, tous les canaux IKCa mutés sont demeurés sensibles au DTNB. L’ensemble de ces données suggère que la régulation par réactions d'oxydoréduction des canaux IRK1 et IKCa des cellules endothéliales implique l’action concomitante de plusieurs résidus cystéine, et que les propriétés de conduction et d'activation de ces canaux dépendent de groupements cystéine spécifiques.