Colloque

Structure de la mannosidase de Saccharomyces cerevisiae impliquée dans la synthèse des N-glycanes : localisation des ponts disulfure

Francesco Lipari

Annette Herscovics

Membre a labase

Francesco Lipari

Résumé du colloque

Durant la formation des N-glycannes chez la levure, S. cerevisiae, une 1,2-mannosidase enlève un seul résidu de mannose de l'oligosaccharide Man9GlcNAc2. Le gène a été isolé et définit une protéine transmembranaire de type II de 63 kDa (1). Cette mannosidase de levure est membre d'une famille de mannosidases qui a été conservée durant l'évolution, incluant des mannosidases de mammifères et de Drosophile. La mannosidase de levure peut donc servir de modèle pour étudier la structure de cette famille d'enzymes. Nous avons établi un système d'expression qui nous permet de produire la région catalytique de la mannosidase de levure (mg) afin de déterminer sa structure (2). On a démontré que la mannosidase de levure contient deux ponts disulfure et une fonction thiol (3). La protéine a été fragmentée avec CNBr et l'endopeptidase Glu-C après traitement avec l'acide iodacétique radioactif (2-3H-ICH2COOH), et les peptides ont été séparés par HPLC. L'analyse N-terminale des peptides radioactifs a démontré que C485 contient la fonction thiol. La mannosidase a été ensuite fragmentée avec CNBr et l'endopeptidase Asp-N, et les peptides ont été fractionnés par HPLC, avant ou après réduction, afin d'identifier les peptides contenant des ponts disulfure. Ceux-ci ont ensuite été caractérisés par leur séquence N-terminale. Les résultats ont été confirmé par HPLC et par spectrométrie de masse d'une digestion trypsique, et démontrent la présence de ponts disulfure entre C340 et C385 et entre C468 et C471. L'alignement des séquences des différentes mannosidases indique que seulement le pont disulfure entre C340 et C385 est conservé. Ces observations suggèrent que la présence d'un pont disulfure additionel entre C468 et C471 dans la mannosidase de levure peut être importante pour assurer la haute specificité de cette enzyme, en comparaison avec les mannosidases de mammifères qui enlèvent quatre résidus de mannose.

Contexte

Section :

Biologie cellulaire et moléculaire

Thème du colloque :

Biologie cellulaire et moléculaire

Hôte : Université McGill

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Titre du colloque :

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