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Communication
Les études de cristallogénèse effectuées sur des macromolécules biologiques visent une compréhension des processus de nucléation et de croissance des cristaux et la recherche d’une façon permettant d’améliorer la qualité de ces cristaux. La 3alpha-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 3 (3alpha-HSD3) couplée à la glutathione sulfotransférase (GST) a été surproduite dans Escherichia coli. L’enzyme purifiée a ensuite été cristallisée sous forme de complexe avec le NADP+ et la testostérone (Zhu et al., 2001). Lors de cette étude, nous cherchons une correlation entre les différentes conditions de croissance des cristaux (e.g. la nature de l’agent cristallisant, sa solubilité, la supersaturation de la …
Communication
La déshydrogénase oestrogénique humaine (17?-HSD1) catalyse la dernière étape dans la biosynthèse des oestrogènes actifs qui stimulent la prolifération des cellules cancéreuses du sein. Bien que la 17?-HSD1 catalyse principalement l’interconversion de l’oestrone (E1) et de l’oestraiol (E2), les données cinétiques ont montré que cette enzyme peut aussi lier et utiliser d’autres substrats secondaires. Afin de mieux comprendre ses spécificités de substrat et de fournir une base plus solide dans l’élaboration d’inhibiteurs, nous avons déterminé la structure cristalline de la 17?-HSD1 en complexe avec la testostérone. Ce complexe binaire a été cristallisé en utilisant la technique du trempage. Un jeu …
Communication
La première structure tridimensionnelle de la 3alpha-hydroxystéroïde déshydrogénase humaine de type 3 (3alpha-HSH3, AKR1C2), une enzyme jouant un rôle critique dans le métabolisme des stéroïdes, a été déterminée par cristallographie en complexe avec la testostérone et le NADP à 1.25 de résolution. L'activité 17beta-HSD de l'enzyme a été étudiée en comparaison de son activité 3alpha-HSD. L'enzyme catalyse l'inactivation de la dihydrotestostérone en 5alpha-androstane-3alpha,17beta-diol (3alpha-diol) ainsi que la transformation de l'androstenediol en testostérone. Utilisant notre préparation très homogène et très active de l'enzyme, nous avons obtenu une spécificité de l'activité 3alpha-HSD 150 fois plus grande que les valeurs précédemment rapportées dans …
Communication
La fructose-1,6-bisphosphatase (Fru-1,6-P2ase, EC 3.1.3.11) catalyse l’hydrolyse du fructose-1,6-bisphosphate (F-1,6-P2) en fructose 6-phosphate (F-6-P) et phosphate inorganique (Pi). Cette enzyme joue un rôle central dans la régulation globale de la gluconéogénèse puisqu'elle constitue la dernière enzyme spécifique de cette voie métabolique. L’activité catabolique de la Fru-1,6-P2ase requiert des ions métalliques divalents tels que Mg2+, Mn2+ et Zn2+ et certains cations monovalents tels que K+, NH4+ et Tl+. La cristallisation de la fructose-1,6-biphosphatase musculaire humaine a été publiée pour la première fois en mars 2001 (Zhu, D.-W., Xu, G.-J., Rehse, P.H., Shi, R., Zhao, F.-K and Lin, S.-X. (2001) Acta Crystallogr. …
Colloque
La 17ß-hydroxystéroide déshydrogénase estrogénique humaine (17ß-HSD1) est responsable de la dernière étape de formation de tous les estrogènes actifs, ceux-ci impliqués dans la prolifération des cellules cancéreuses du sein. Afin de mieux comprendre le mécanisme de réaction de la 17ß-HSD1, nous avons effectués les travaux suivants: dans un premier temps, nous avons déterminé les constantes cinétiques (Km, Kcat...) de la 17ß-HSD1 à 37°C dans un tampon phosphate à pH 7.5 afin de reproduire le mieux possible les conditions physiologiques. L’activité du type 1 fut testée pour les substrats suivants: 20 alpha-hydroxyprogestérone, DHT, DHEA, estradiol et estrone. Nous avons obtenus les …
Colloque
La 5 alpha-réductase humaine est une enzyme jouant un rôle clé dans la transformation de la testostérone en dihydrotestostérone. Cette dernière est un puissant androgène, responsable de la différentiation des organes génitaux externes mâles et de la prostate. Elle est aussi impliquée dans le développement de maladies humaines androgéno-dépendantes, telles que le cancer de la prostate et l’hyperplasie prostatique bénigne. Afin de concevoir des inhibiteurs efficaces et spécifiques pouvant se révéler utiles dans le traitement du cancer de la prostate, nous avons entrepris des études de crystallisation dont le but est d’établir la structure de la 5 alpha-réductase humaine. Ces …
Colloque
La 17beta-hydroxystéroïde déhydrogénase est une enzyme clé pour la synthèse des hormones actif à partir des précurseurs stéroïdiens. Elle catalyse une réaction d'oxido-réduction réversible entre l'estradiol et l'estrone en présence des cofacteurs NAD(H) ou NADP(H). Cette enzyme est capable d'utiliser les deux cofacteurs NAD(H) et NADP(H), mais avec une affinité 100 fois plus élevée pour le NADP+ par rapport au NAD+. Pour comprendre la base structurale de la liaison des cofacteurs, nous avons résolu par crystallographie trois structures tridimentionnelles de la 17beta-HSD1 en liaison avec le NAD à une résolution de 2.5 A, et en liaison avec un inhibiteur (EM553) …
Colloque
La 17b-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 1 humaine (17b-HSD1) joue un rôle important dans la conversion des estrogènes. Sa principale activité est de convertir l’estrone en 17b-estradiol en utilisant un cofacteur, le NAD(P)H. La molécule EM519 est le nom donné au 17a-butyl-17b-estradiol, un inhibiteur compétitif de la 17b-HSD1. Notre groupe a cristallisé le complexe ternaire 17bHSD1-NADP+-EM519 par la méthode de co-cristallisation. L’enzyme a été purifiée à l’aide d’une colonne Mono Q et à été concentrée en présence de 20% glycérol et de 0,06% b-octylglucoside. La concentration finale de l’échantillon est supérieure à 15 mg/ml. La méthode de diffusion de vapeur a …
Colloque
La 17b-Hydroxystéroïd déshydrogénase1 (17b-HSD1) intervient dans la formation des hormones stéroïd actives qui stimulent les cancers hormono-dépendants. La 17b-HSD1 a subi une protéolyse par la subtilisine. La réaction à été faite à un pH de 7.5, 37°C. La masse de chacun des polypeptides obtenus a été déterminée par l'électrophorèse de gel de polyacrylamide en présence de SDS. Un polypeptide de 32 kDa a été obtenu par chromatographie l'intéraction hydrophobique. L'analyse de la séquence du côté N-terminale nous a indiqué que les cinq premiers acide aminés en N-terminale de la 17b-HSD ayant subi la protéolyse sont identiques que celui la de …
Colloque
La 17b-hydroxysteroïd déshydrogenase estrogenique (17b-HSD1) est résponsable de la formation d'estradiol, l'estrogène le plus active. La technique de dialyse à l'équilibre a été utilisée pour étudier l'interaction entre la protéine et le ligand. La liaison des substrats, des cofacteurs et des inhibiteurs avec la 17b-HSD1 a été étudiée par cette technique. Les données ont été analysées par graphique de Scatchard. Les KD de NAD et de NADP étaient respectivement de 73.7 mM et de 0.4 mM. Les résultats ont montré que la 17b-HSD1 a environ 185 fois plus d'affinité pour le NADP que pour le NAD. Les KDs pour les …
