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Colloque
Les protéines sécrétées sont généralement synthétisées avec une courte séquence à leur extrémité N-terminale, appelée peptide signal (p.s.), qui permet l'initiation de la sécrétion et qui est subséquemment clivée pour libérer la protéine mature. Ce travail présente une étude comparative de l'effet de divers p.s. sur la production de la xylanase A, une enzyme d'intérêt industriel. Les p.s. des cellulases A et B (CelA et B), de la mannanase (Man), de l'acétyl xylan estérase (Axe), et des xylanases B et C (XlnB et C) de S. lividans, ainsi que le p.s. de la protéine réceptrice du phage lambda (lamB) d'E. …
Colloque
S. lividans est un grand producteur de protéines d'intérêt industriel (xylanases, cellulases, etc.), la plupart étant des enzymes sécrétées. Toutefois, le système de sécrétion bactérien y a été très peu étudié jusqu'ici. L'amélioration du système de sécrétion favoriserait grandement l'application industrielle de ces enzymes. Nous avons donc isolé le facteur SecY, une protéine transmembranaire essentielle, impliquée dans le mécanisme de sécrétion. Du contact entre les différentes amorces, il se dégage un consensus pour un opéron identique. En se basant sur l'analyse des séquences des amorces, nous avons cloné chez les streptomyces des bandes d'ADN dégénérées et obtenues à partir de …
Colloque
Le xylane est un hétéropolymère composé d'une chaîne principale de xyloses, liées entre eux par des liens β-1,4 et pouvant être substituée par des groupements arabinosyles ou autres sucres, tout dépendant de son origine végétale. L'hydrolyse enzymatique du xylane dans la pâte de papier permet de libérer la lignine et de faire le blanchiment du papier en diminuant l'utilisation de chlore, principal polluant du procédé. Nous avons cloné et caractérisé des gènes de xylanase produits par des mutants de la xylanase A où un seul acide aminé a été modifié en utilisant un système de mutagenèse in vitro dirigée par …
Colloque
Les arabinofuranosidases sont des enzymes capables d'hydrolyser les résidus arabinose contenus dans divers polysaccharides complexes, dans des oligosaccharides ou des substrats synthétiques plus simples. Le gène codant pour une α-L-arabinofuranosidase (abfA) a été cloné de façon homologue dans un vecteur multicopie (pIJ702) chez Streptomyces lividans. Un clone hyperproducteur a été sélectionné et la production de cette enzyme intracellulaire a été réalisée. Différentes étapes (éclatement de mycélium, précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie par interactions hydrophobes, chromatographie échangeuse d'ions et criblage moléculaire) ont permis de purifier cette enzyme arabinofuranosidase à un poids moléculaire de 67,000 Da sur SDS-PAGE et environ 250,000 Da …
Colloque
La souche S. lividans est une bactérie du sol qui produit 2 cellulases, 3 xylanases, 1 mannanase et 1 arabinofuranosidase. Nous avons établi la séquence du gène celB. Celle-ci contient, contrairement à celA, 2 palindromes de 12 nt. en amont du promoteur présomptif. Cette structure secondaire est fréquemment observée chez les gènes encodant les cellulases et elle serait impliquée dans la régulation de l'expression. Le site de fixation des ribosomes GGAG est séparé de 8 nt du codon d'initiation ATG. Étant donné qu'il s'agit d'une protéine sécrétée, on retrouve un peptide signal à l'extrémité N-terminale qui démontre les propriétés biochimiques …
Colloque
Les streptomycètes sont des bactéries filamenteuses produisant un grand nombre d'antibiotiques et d'enzymes extracellulaires. S. lividans 1326 est reconnu pour synthétiser entre autres 3 xylanases et 2 cellulases. Par mutagénèse NTG de la souche sauvage 1326, un mutant pléiotropique se révélant incapable d'agir a été obtenu. Le mutant 10-164 présente des problèmes en ce qui a trait à l'induction des cellulases et xylobioses, incluant l'absence de synthèse de l'une des cellulases, plus les monosaccharides tels le xylose et le glucose présentent plus difficilement dans les cellules du mutant. Ce problème pourrait être causé par une altération au niveau de la …
Colloque
Les streptomycètes sont des bactéries ayant pour habitat naturel le sol. Ils produisent un grand nombre d’enzymes extracellulaires tels les cellulases et les xylanases. Deux cellulases et trois xylanases ont ainsi été clonées par complémentation fonctionnelle dans le mutant 10-164, xylanase- et cellulase- de S. lividans. Ce mutant obtenu par mutagénèse de la souche sauvage 1326 au NTG, est devenu un outil important pour le clonage et l’expression de gènes impliqués dans la dégradation de la matière lignocellulosique. Paradoxalement, le facteur affecté par la mutation n’est pas connu. Il a alors été proposé que le système de transport des sucres …
Colloque
Les xylanases sont des hydrolases qui dégradent le xylane, un polymère constitué d'unités de D-xylose liées entre elles par des liaisons β-1,4. La comparaison de différentes séquences d'acides aminés de xylanases avec celles de levures a permis de cibler les acides aminés conservés. Dans le but de leur attribuer un rôle, ces acides aminés ont été substitués par mutagenèse dirigée et le gène ainsi altéré exprimé chez Escherichia coli. La conversion de l'Asp 124 en acide glutamique ou en arginine diminue l'activité catalytique de 5 et 9 fois respectivement. L'étude de la cinétique d'hydrolyse de différents oligosylosides (X, x Y) …
Colloque
Le gène xylA du plasmide pTAF18 de S. lividans 1AF18 ainsi que le gène xylB du plasmide pTAF42 de S. lividans 1AF42 ont été sous-clonés indépendamment chez E. coli JM83 à l'aide du phagémide pTZ18-U. Les transformants obtenus contenant les plasmides pXylA, pXylB ou pXBI et exprimant les xylanases produisent des zones d'éclaircissement sur gélose au xylan contenant du bleu trypan, indiquant la présence de ces gènes chez E. coli nécessite la présence d'un promoteur hétérologue qui permet de démontrer très clairement que l'on retrouve majoritairement dans l'espace périplasmique. Une étude comparant l'activité par western a démontré que les xylanases …
Colloque
Le gène d'une β-mannanase a été cloné de façon homologue. Une banque génomique de S. lividans, comprenant 25000 clones, a été constituée dans le vecteur pIJ 702. Le criblage des clones a été réalisé sur un milieu solide contenant du galactomannane et la détection a été déterminée par l'hydrolyse du substrat. Trois clones positifs ont été identifiés et par sous-clonage il a été possible de localiser le gène codant pour la mannanase. L'expression de ces clones dans le double mutant 10-164 (cellulase et xylanase négatifs) de S. lividans a mis en évidence l'un d'entre eux qui produit environ soixante fois …
