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Colloque
Les protéines sécrétées sont généralement synthétisées avec une courte séquence à leur extrémité N-terminale, appelée peptide signal (p.s.), qui permet l'initiation de la sécrétion et qui est subséquemment clivée pour libérer la protéine mature. Ce travail présente une étude comparative de l'effet de divers p.s. sur la production de la xylanase A, une enzyme d'intérêt industriel. Les p.s. des cellulases A et B (CelA et B), de la mannanase (Man), de l'acétyl xylan estérase (Axe), et des xylanases B et C (XlnB et C) de S. lividans, ainsi que le p.s. de la protéine réceptrice du phage lambda (lamB) d'E. …
Colloque
Les arabinofuranosidases sont des enzymes capables d'hydrolyser les résidus arabinose contenus dans divers polysaccharides complexes, dans des oligosaccharides ou des substrats synthétiques plus simples. Le gène codant pour une α-L-arabinofuranosidase (abfA) a été cloné de façon homologue dans un vecteur multicopie (pIJ702) chez Streptomyces lividans. Un clone hyperproducteur a été sélectionné et la production de cette enzyme intracellulaire a été réalisée. Différentes étapes (éclatement de mycélium, précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie par interactions hydrophobes, chromatographie échangeuse d'ions et criblage moléculaire) ont permis de purifier cette enzyme arabinofuranosidase à un poids moléculaire de 67,000 Da sur SDS-PAGE et environ 250,000 Da …
Colloque
Les streptomycètes sont des bactéries filamenteuses produisant un grand nombre d'antibiotiques et d'enzymes extracellulaires. S. lividans 1326 est reconnu pour synthétiser entre autres 3 xylanases et 2 cellulases. Par mutagénèse NTG de la souche sauvage 1326, un mutant pléiotropique se révélant incapable d'agir a été obtenu. Le mutant 10-164 présente des problèmes en ce qui a trait à l'induction des cellulases et xylobioses, incluant l'absence de synthèse de l'une des cellulases, plus les monosaccharides tels le xylose et le glucose présentent plus difficilement dans les cellules du mutant. Ce problème pourrait être causé par une altération au niveau de la …
Colloque
La souche S. lividans est une bactérie du sol qui produit 2 cellulases, 3 xylanases, 1 mannanase et 1 arabinofuranosidase. Nous avons établi la séquence du gène celB. Celle-ci contient, contrairement à celA, 2 palindromes de 12 nt. en amont du promoteur présomptif. Cette structure secondaire est fréquemment observée chez les gènes encodant les cellulases et elle serait impliquée dans la régulation de l'expression. Le site de fixation des ribosomes GGAG est séparé de 8 nt du codon d'initiation ATG. Étant donné qu'il s'agit d'une protéine sécrétée, on retrouve un peptide signal à l'extrémité N-terminale qui démontre les propriétés biochimiques …
Colloque
Streptomyces lividans produit trois xylanases différentes au cours de l’induction par le xylane. Les xylanases B et C hydrolysent le xylane en oligosylosides de trois à dix résidus de xylose tandis que la xylanase A libère de ceux-ci principalement du xylobiose qui est une source de carbone assimilable grâce à l’action de la β-xylosidase. Toutes ces enzymes participent donc à la dégradation complète du xylane. Nous avons étudié l’apparition séquentielle des ARN, de chacune des xylanases. Un hydrolysat de xylane de glucanes d’avoine (X3-X9) a été utilisé parce que le xylane ne permet pas la préparation d’ARN pur à cause …
Colloque
Les streptomycètes sont des bactéries ayant pour habitat naturel le sol. Ils produisent un grand nombre d’enzymes extracellulaires tels les cellulases et les xylanases. Deux cellulases et trois xylanases ont ainsi été clonées par complémentation fonctionnelle dans le mutant 10-164, xylanase- et cellulase- de S. lividans. Ce mutant obtenu par mutagénèse de la souche sauvage 1326 au NTG, est devenu un outil important pour le clonage et l’expression de gènes impliqués dans la dégradation de la matière lignocellulosique. Paradoxalement, le facteur affecté par la mutation n’est pas connu. Il a alors été proposé que le système de transport des sucres …
Colloque
Les xylanases sont des hydrolases qui dégradent le xylane, un polymère constitué d'unités de D-xylose liées entre elles par des liaisons β-1,4. La comparaison de différentes séquences d'acides aminés de xylanases avec celles de levures a permis de cibler les acides aminés conservés. Dans le but de leur attribuer un rôle, ces acides aminés ont été substitués par mutagenèse dirigée et le gène ainsi altéré exprimé chez Escherichia coli. La conversion de l'Asp 124 en acide glutamique ou en arginine diminue l'activité catalytique de 5 et 9 fois respectivement. L'étude de la cinétique d'hydrolyse de différents oligosylosides (X, x Y) …
Colloque
Le gène d'une β-mannanase a été cloné de façon homologue. Une banque génomique de S. lividans, comprenant 25000 clones, a été constituée dans le vecteur pIJ 702. Le criblage des clones a été réalisé sur un milieu solide contenant du galactomannane et la détection a été déterminée par l'hydrolyse du substrat. Trois clones positifs ont été identifiés et par sous-clonage il a été possible de localiser le gène codant pour la mannanase. L'expression de ces clones dans le double mutant 10-164 (cellulase et xylanase négatifs) de S. lividans a mis en évidence l'un d'entre eux qui produit environ soixante fois …
Colloque
Il n'existe pas de technique de mutagénèse dirigée applicable directement aux streptomycètes. Afin de réaliser ces expériences, il faut avoir cloné le gène d'abord chez E. coli avec un vecteur approprié puis après avoir effectué la mutagénèse, il faut recolier le fragment muté dans un vecteur de streptomycète pour évaluer les effets des mutations introduites. Pour éviter les travaux de sous-clonage, un vecteur navette a été construit. Ce vecteur pFZ12 (6.7 Kb) se compose du phagemid pFZ19 (2.8 Kb) qui se réplique chez E. coli, qui produit le phage filamenteux et qui peut porter une simple brin en utilisant le …
Colloque
Le gène xylA du plasmide pTAF18 de S. lividans 1AF18 ainsi que le gène xylB du plasmide pTAF42 de S. lividans 1AF42 ont été sous-clonés indépendamment chez E. coli JM83 à l'aide du phagémide pTZ18-U. Les transformants obtenus contenant les plasmides pXylA, pXylB ou pXBI et exprimant les xylanases produisent des zones d'éclaircissement sur gélose au xylan contenant du bleu trypan, indiquant la présence de ces gènes chez E. coli nécessite la présence d'un promoteur hétérologue qui permet de démontrer très clairement que l'on retrouve majoritairement dans l'espace périplasmique. Une étude comparant l'activité par western a démontré que les xylanases …
