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Colloque
L'endopeptidase neutre-24.11 (EC 3.4.24.11) (EPN) est une métallo-endopeptidase transmembranaire présente dans de nombreux tissus. Elle est particulièrement abondante à la surface apicale de la membrane de la bordure en brosse des tubules rénaux proximaux. Elle s'avère donc être un bon marqueur de surface pour étudier le ciblage des protéines membranaires de ce type de cellules polarisées. Afin de déterminer quel domaine de cette enzyme contient l'information nécessaire à son acheminement vers le domaine apical, nous avons reconstitué un modèle cellulaire de ciblage d'une forme soluble de l'EPN (EPNS) dans la ligne cellulaire polarisée "Madin-Darby Canine Kidney" (MDCK) et ce, à …
Colloque
L'endopeptidase neutre (NEP) est une métallopeptidase à zinc impliquée dans la dégradation de neuropeptides tels que les enképhalines ou d'hormones polypeptidiques comme le facteur atrial natriurétique ou l'endothéline (ANP). Parce qu'elle peut servir de modèle pour la modulation de certaines réponses physiologiques, l'architecture du site actif de la NEP fait l'objet de beaucoup de recherches depuis la dernière décennie. Notamment, c'est par les techniques de génie génétique que notre équipe en 1987 a pu déterminer la structure primaire de la NEP et enfin le lapin. Des études antérieures destinées à déterminer le mécanisme catalytique de l'enzyme ont démontré la présence …
Colloque
L'EPN est un ectoenzyme membranaire impliqué dans la dégradation de nombreux peptides. Nous poursuivons une série d'études visant à cerner les structures nécessaires au transport intracellulaire de la protéine et son activité enzymatique. L'EPN étant une glycoprotéine, comme la majorité des protéines membranaires, l'ADNc a été modifié par mutagenèse dirigée afin d'éliminer progressivement les 5 sites potentiels de glycosylation par les asparagines et les glutamines. L'utilisation d'un promoteur eucaryote a ensuite permis l'expression des protéines mutantes ont été examinées par électrophorèse et immunoprécipité à l'aide d'anticorps spécifiques. Le rapport entre les sites de glycosylation et l'activité entraîne une rétention graduelle …
Colloque
L'endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11, EPN) est une métallopeptidase à zinc ancrée dans la membrane plasmique de nombreux types cellulaires. L'enzyme est impliquée dans la dégradation des peptides biologiquement actifs et en particulier des enképhalines et du facteur natriurétique de l'oreillette. Cette enzyme est donc la cible pour la synthèse d'inhibiteurs qui pourraient être utilisés comme nouveaux agents analgésiques ou anti-hypertenseurs. De façon à définir la structure du site actif de l'enzyme nous avons utilisé la technique de mutagénèse dirigée pour identifier les acides aminés impliqués dans la coordination du zinc, la liaison du substrat et le mécanisme catalytique. D'autre part, …
Colloque
L'endopéptidase neutre se compose d'un domaine extracellulaire, incluant le site actif de l'enzyme, retenu à la membrane par un domaine transmembranaire servant aussi de peptide signal. Nous avons voulu déterminer si ce type de protéine peut devenir sécrétée en remplaçant le signal/ancrage par un peptide signal de protéine sécrétée. Les séquences ADNc codant pour le domaine extracellulaire ont été fusionnées à celles du peptide signal d'une protéine sécrétée (pro-opiomélanocortine). L'ADN recombinant obtenu a été exprimé transitoirement dans les cellules COS-1 en utilisant le promoteur du virus SV40. La protéine a été ensuite été analysée sur gel de SDS-polyacrylamide et immunodétection. …
Colloque
Le mécanisme moléculaire impliqué dans le ciblage des neuropeptides vers les granules de sécrétion se réalise probablement par l'intermédiaire d'un "signal" présent sur la protéine. Notre étude consiste à localiser ce "signal" sur la structure protéique de la Pro-opiomélanocortine (POMC). Plusieurs formes tronquées du précurseur POMC ont été produites par mutagénèse dirigée de l'ADNc de la POMC. Les ADNc modifiés ont été exprimés dans une lignée neuroendocrine (Neuro 2A) par l'entremise d'un vecteur rétroviral. Des analyses par immunohistochimie de même que des essais de stimulation de la sécrétion nous permettent de visualiser la localisation intracellulaire des neuropeptides et de vérifier …
Colloque
La sélection d'anticorps monoclonaux spécifiques à l'énképhalinase de la membrane de bordure en brosse (MBB) du tube proximal du rein de lapin s'avère un outil précieux pour purifier et caractériser cette enzyme. Une réaction croisée contre l'énképhalinase de rat et de porc a été démontrée par immunoprécipitation sur papier de nitrocellulose après SDS-PAGE. L'anticorps monoclonal nous a permis de démontrer la présence de l'énképhalinase dans les MBB rénale et intestinale chez le rat, de même qu'au niveau de la bordure d'intestin grêle de foetus humain âgé de 20 semaines. L'énképhalinase rénale et intestinale de ces différentes espèces a été purifiée …
