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Communication
La synthèse de la protéine Gag-Pol, le précurseur des activités enzymatiques du VIH-1, requiert un changement du cadre de lecture (frameshift) programmé –1 lors de la traduction de l'ARN messager viral. Les ribosomes effectuent ce frameshift au niveau d’une séquence glissante spécifique, suivie d’une structure particulière, le signal stimulateur, qui interagirait avec les ribosomes pour stimuler le frameshift. Chez le groupe M du VIH-1, le groupe le plus répandu dans le monde, ce signal est une longue hélice irrégulière, alors que chez le groupe O, rencontré surtout en Afrique, ce signal est un pseudonoeud. Notre but est d’étudier si le …
Communication
La synthèse de Gag-Pol, le précurseur des enzymes du VIH, requiert un changement du cadre de lecture (frameshift) programmé au niveau d’une séquence glissante spécifique lors de la traduction de l’ARN messager viral par les ribosomes. Nous avons montré qu’on peut reproduire ce frameshift dans un système bactérien et étudier l’effet de mutations dans le ribosome sur ce frameshift. Nous utilisons un plasmide avec un ARN à opéron ribosomique modifié tel que seuls les ribosomes avec un ARN 16S codé par le plasmide traduisent l’ARNm correspondant à un gène rapporteur, codant pour la luciférase de la luciole. Au début de …
Communication
Les interactions RNA-protéines jouent un rôle crucial dans le contrôle de plusieurs phénomènes vitaux. Notre but est de caractériser la liaison entre la protéine ribosomique S7 de la petite sous-unité ribosomique d'Escherichia coli à une portion du domaine 3' majeur du RNA ribosomique 16S. Nous utilisons un plasmide, pFD3LH, à partir duquel nous pouvons produire par transcription in vitro la portion du RNA qui lie la protéine S7. Nous avons aussi cloné le gène correspondant à la protéine S7 dans un vecteur d'expression bactérien sous contrôle d'un promoteur T7. Une queue d'histidines a été introduite dans la partie N-terminale de …
Communication
La synthèse de la protéine Gag-Pol, le précurseur des activités enzymatiques du virus VIH, requiert un déphasage (frameshift) programmé de type –1 du cadre de lecture lors de la traduction de l’ARN messager viral par les ribosomes des cellules infectées. Ce frameshift se produit au niveau d’une séquence glissante (U UUU UUA) suivie en 3’ d’une séquence stimulatrice en tige-boucle. Nous avons voulu déterminer si la région suivant la tige-boucle pouvait également influencer le frameshift. Nous avons introduit la région de frameshift du VIH incluant la séquence glissante, la tige-boucle et la portion adjacente à cette tige-boucle, au début de …
Colloque
Les interactions RNA-protéines contrôlent de multiples processus biologiques et le ribosome constitue un modèle intéressant d'études de ces interactions. Le gène codant pour la protéine S7 de la petite sous-unité ribosomique d'E. coli a été isolé par amplification au PCR à partir du DNA génomique de la bactérie E. coli K12A19. Ce gène a été muni d'un "tag à histidine", introduit dans le vecteur d'expression pET21a(+), et exprimé dans les cellules BL21(DE3)pLysS. Des mutations par délétion ou par substitution ont été introduites dans différentes portions de la protéine, principalement les portions N et C terminales et une portion centrale correspondant …
Colloque
Le déphasage programmé du cadre de lecture d'un RNA messager (mRNA) est un mécanisme essentiel pour la production de la protéine gag-pol, le précurseur des protéines enzymatiques du VIH (virus de l'immunodéficience humaine). Lors de ce déphasage, il y a glissement des ribosomes dans un nouveau cadre de lecture au niveau d'une séquence glissante spécifique du mRNA. Nous avons voulu étudier ce déphasage du cadre de lecture dans un système procaryote. Une cassette de DNA codant pour la séquence glissante du RNA du VIH suivie d'une structure stimulatrice en tige-boucle a été insérée au début de la séquence codante de …
Colloque
Chez les bactéries, l'initiation de la synthèse protéique débute par la liaison de la sous-unité ribosomique 30S à des sites spécifiques sur les RNA messagers. Cette liaison est contrôlée par l'interaction de Shine-Dalgarno, entre l'extrémité 3' du RNA 16S et une séquence complémentaire précédant la région codante des RNA messagers. Cependant, plusieurs indications dans la littérature suggèrent que des interactions additionnelles favoriseraient l'initiation de la traduction de certains messagers, comme par exemple, des appariements entre le début de la région codante d'un messager et la région à l'extrémité 5' du RNA 16S. Pour vérifier cette suggestion, nous avons construit un …
Colloque
La caractérisation du site de liaison d'une protéine sur le RNA ribosomique peut préciser quels sont les signaux qui contrôlent la spécificité de cette interaction RNA - protéine. Nous avons examiné l'interaction de la protéine S7 avec le RNA 16S du ribosome d'E. coli. On sait que cette protéine interagit avec le domaine 3 du RNA 16S. Différents plasmides ont été construits, à partir desquels nous pouvons obtenir par transcription in vitro soit le domaine 3 complet (positions 926 à 1393), soit divers fragments de ce domaine. Nous avons ensuite examiné, par la technique de filtration sur membranes de nitrocellulose, …
Colloque
Des délétions (de 5 à 16 nucléotides) ou des substitutions ont été introduites dans la région 5' terminale du gène du RNA 16S d'E. coli, dans l'opéron rrnB du plasmide pKK3535 ou dans le phagemide pDL4417 (où il est sous contrôle d'un promoteur T7). Les ribosomes ont été extraits de bactéries transformées avec les mutants dérivés de pKK3535 et leur activité de synthèse a été évaluée par une batterie d'essais (synthèse sous la direction de messagers artificiels ou naturels, réponse à des agents qui induisent des erreurs de lecture...). Le RNA 16S a aussi été extrait à partir de mutants …
Colloque
Le RNA 16S de la sous-unité 30S du ribosome bactérien est divisé en 4 domaines principaux. À partir d'un plasmide contenant le gène du RNA 16S d'E. coli sous contrôle d'un promoteur T7, nous avons construit des plasmides permettant la transcription in vitro des domaines 1 et 2, le domaine 3 et les domaines 3 et 4 du RNA 16S. Ces domaines isolés doivent globalement conserver leur structure native. Le RNA 16S peut interagir avec la sous-unité 50S in vivo. Les domaines "mini-sous-unités" 30S, isolés à partir de mutants de protéines absentes de la sous-unité 30S (S4, S6, S8, S15, …
