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Colloque
Vibrio costicolus est une bactérie modérément halophile qui croît dans un milieu contenant 1 M NaCl. La courbe de croissance, obtenue par turbidité, a été liée au nombre de bactéries produites, grâce à la numération des sphéroplastes. À cause de l'inhibition du lysozyme par le sel et de la susceptibilité des sphéroplastes aux faibles forces ioniques, la méthode enzymatique d'obtention des sphéroplastes n'est pas possible, mais la méthode au sucrose est efficace. Les sphéroplastes peuvent être comptés dans une chambre de Petroff-Hausser, et le contrôle de viabilité effectué par frottis sur gélose. La mesure du nombre de cellules et de …
Colloque
Le RNA total de foie de rat a été purifié par différentes méthodes: extraction au phénol, traitement au chlorure ou au thiocyanate de guanidine, centrifugation sur coussin de chlorure de césium et digestion des polysomes à la protéinase K. La méthode de centrifugation sur coussin de CsCl a été sélectionnée pour son rendement élevé en mRNA de haut poids moléculaire. L'étape suivante a été l'isolement des RNA messager par chromatographie d'affinité sur colonne d'oligo-dT. L'activité de traduction a été mesurée par incorporation de méthionine 35S dans un système de réticulocytes de lapin. La synthèse de pyruvate kinase L peut être …
Colloque
Des extraits de foie de rats sont préparés en vue d'obtenir la pyruvate kinase L soit sous forme non phosphorylée active, soit sous forme phosphorylée inactive. La pyruvate kinase L n'est pas phosphorylée chez des rats mis à jeun pendant 48 heures puis nourris avec une diète riche en sucre (1/3 moulée, 2/3 fructose). La pyruvate kinase L phosphorylée est obtenue à partir de rats soumis à une diète normale qui reçoivent, avant d'être sacrifiés, une injection intraveineuse de glucagon. L'inosine n'affecte pas l'activité de la pyruvate kinase dans des extraits de foies de rats nourris avec une diète riche …
Colloque
Des extraits de foie de rats sont préparés en vue d'obtenir la pyruvate kinase L soit sous forme non phosphorylée active, soit sous forme phosphorylée inactive. La pyruvate kinase L n'est pas phosphorylée chez des rats mis à jeun pendant 48 heures puis nourris avec une diète riche en sucre (1/3 moulée, 2/3 fructose). La pyruvate kinase L phosphorylée est obtenue à partir de rats soumis à une diète normale qui reçoivent, avant d'être sacrifiés, une injection intraveineuse de glucagon. L'inosine n'affecte pas l'activité de la pyruvate kinase dans des extraits de foies de rats nourris avec une diète riche …
Colloque
La pyruvate kinase de Halobacterium cutirubrum, une bactérie extrême halophile, est diminuée irréversiblement à concentration en NaCl plus petite que 4M. Cette propriété rend sa purification complète difficile. Les chromatographies d'hydroxylapatite et d'exclusion dans 4M NaCl ont été utilisées avec succès. La chromatographie sur hydroxylapatite et la chromatographie d'affinité dans 4M NaCl donnent des indices de purification faibles. La préparation partiellement purifiée de pyruvate kinase nécessite un cofacteur divalent: Mg++ ou Mn++. Elle est activée par les cations monovalents 3M par rang d'efficacité: K+ > Rb+ > Na+ > Cs+ > NH4+ > Li+. Le maximum d'activation est obtenu à …
Colloque
La pyruvate kinase de Vibrio costicola a un poids moléculaire de 270,000 g/mol mesuré par chromatographie d'exclusion dans un milieu contenant 25% de glycerol. En absence de glycerol, l'enzyme a un poids moléculaire moyen inférieur, mesuré par centrifugation à l'équilibre. La dilution de l'enzyme réduit son activité spécifique suivant un équilibre monomère-tétramère. Le substrat phosphoénolpyruvate et l'activateur adénosine monophosphate rétablissent l'activité spécifique maximum. En absence d'activateur l'enzyme dilué présente une cinétique biphasique pour des concentrations croissantes de phosphoénolpyruvate. Ce phénomène est attribué à la polymérisation de l'enzyme en une forme plus active sous l'influence du substrat.
Colloque
Vibrio costicola est une bactérie modérément halophile qui requiert une concentration molaire de sel pour sa croissance. Comme la concentration intracellulaire de sel s'élève à la même valeur, il s'ensuit que les enzymes de Vibrio costicola l'encontre sont dans un environnement capable d'inhiber considérablement les enzymes normaux. Parmi ces enzymes des halophiles, la pyruvate kinase a été étudiée pour investiguer l'effet du sel sur sa cinétique. La pyruvate kinase de Vibrio costicola présente une cinétique remarquable caractérisée par la présence d'un plateau. L'enzyme a été purifiée jusqu'à l'homogénéité et présente la même cinétique à l'état pur que dans un extrait …
Colloque
Vibrio costicola est une bactérie modérément halophile, aérobique stricte, capable de pousser sur un milieu minimum sels-glucose. L'activité de la pyruvate kinase est mesurée dans l'extrait cellulaire grâce à l'essai spectrophotométrique de la réaction couplée avec la lactico-déshydrogénase. Les concentrations en phosphoénolpyruvate, ADP, NADH et lactico-déshydrogénase ont été optimisées pour des concentrations variables en sel (NaCl ou KCl). L'activité pyruvate kinase semble être inhibée par des concentrations de sel comparables aux conditions intracellulaires. Une purification préliminaire de l'extrait cellulaire a été réalisée par élimination des acides nucléiques à la protamine sulfate et chromatographie d'exclusion.
Colloque
L'activité de la pyruvate kinase de Vibrio costicola, purifiée par chromatographie sur Sephadex G-75, est mesurée dans des conditions standards: température ambiante, 0.1M KCl et substrats saturants. Lorsque l'enzyme est pré-incubée dans des conditions différentes de température et de concentration en sel, son activité standard est modifiée. Une pré-incubation à 30°C, augmente son activité et la présence d'une haute concentration en sel augmente sa stabilité. L'inactivation observée lors de la pré-incubation à 40°C, est partiellement réversible en ramenant la température à 30°C. Lorsque l'essai enzymatique est conduit à des concentrations variables en phosphoénolpyruvate, la réaction apparait biphasique. Les résultats sont …
Colloque
La chymotrypsine A de porc a été obtenue à partir d'un extrait acide de pancréas, par chromatographie d'affinité. Ses critères de pureté incluent l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, la composition en acides aminés, l'activité spécifique élevée et le titrage des sites actifs. Ses propriétés catalytiques dans l'hydrolyse de l'acétyltyrosinate d'éthyle ont été mesurées en fonction du pH. La variation des constantes de Michaelis révèle les pK des groupes ionisables responsables de l'activité de l'enzyme. L'homologie des chymotrypsines A de porc et de boeuf se vérifie dans le domaine cinétique.
