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Colloque
Nous avons déjà montré que la photolyse d'(iso)desmosines, qu'elles soient isolées ou en lien peptidique, se traduit par l'ouverture du noyau pyridinique, l'éclatement du résidu lysine et probablement une énone substituée. Afin de compléter le clivage de ce dernier produit et de séparer toutes les chaînes latérales des (iso)desmosines, nous avons étudié l'effet de l'ozone. La desmosine traitée après photolyse par l'ozone dans du méthanol-HCl, se décompose en 5 produits, parmi lesquels se trouvent l'acide glutamique et l'acide α-aminoadipique. La photolyse et l'ozonolyse de peptides réticulés ou d'élastine insoluble se traduit aussi par une augmentation d'acide glutamique et d'acide α-aminoadipique. …
Colloque
Les granules purifiés ont été fixés au glutaraldéhyde et observés au microscope électronique après cryodécapage et gravure. Outre le petit nombre de particules intramembranaires sur les surfaces E et P des membranes, des nodules importants ont été observés sur la surface PS ainsi qu'une réticulation sur la surface ES. Les schémas électrophorétiques des protéines solubilisées à partir de membranes purifiées de granules, avec ou sans lavage à pH 11,5 ont été comparés avec ceux obtenus avec les protéines obtenues à partir de lysat de grains zymogènes de suc pancréatique. Cinq protéines membranaires ont été ainsi identifiées, l'une d'entre elles étant …
Colloque
Les membranes purifiées à partir de grains zymogènes apparaissent comme des vésicules lorsqu'on les examine au microscope électronique. En l'absence de marqueurs morphologiques qui pourraient indiquer si les vésicules ont toutes la même polarité, nous avons examiné leur comportement dans un champ électrique assurant que les deux faces de la membrane pourraient porter des densités de charges différentes et donc migrer de façon différente. Nous avons fait les expériences dans une colonne d'électrophorèse liquide, remplie avec une solution de sucrose 0.65M, tamponnée à pH 6.0. La colonne était stabilisée par un gradient linéaire H2O/D2O, et le courant était ajusté à …
Colloque
Les liaisons croisées les plus importantes qui confèrent à l'élastine ses propriétés d'élasticité et son insolubilité sont constituées d'(Iso) désmosines, composées d'un noyau pyridinium tétrasubstitué. Ces acides aminés peuvent relier au moins deux chaînes polypeptidiques, ce qui rend les études de structure de l'élastine très difficiles. Nous savons que les (Iso) désmosines sont dégradées après irradiation à 280 nm. Nous avons entrepris l'irradiation de nos peptides réticulés pour observer le comportement sous irradiation des liaisons croisées présentes dans des chaînes polypeptidiques et pour vérifier si ces chaînes peuvent se séparer. Après irradiation à 280 nm d'un peptide réticulé, nous avons …
Colloque
Lors de l'irradiation à 254nm d'élastine, nous avons observé par analyse d'acide aminé suivant une hydrolyse acide, une disparition avec le temps d'(Iso)désmosines qui comporte trois phases distinctes. Nous avons interprété cette observation en supposant que l'élastine contient non seulement ces résidus d'(Iso)désmosines mais aussi au moins deux autres classes de précurseurs de photosubstitués d'élastine. Cette hypothèse est supportée par les observations supplémentaires suivantes: 1) lorsque l'élastine est irradiée dans le visible, seul ce composé de lysine pyridinium est détruit, 2) lorsque des peptides élastolytiques sont traités dans de l'HCl dilué, une absorption à 280nm apparaît, mais l'absorption à 250nm …
Colloque
Les grains zymogènes du pancréas ont été purifiés par centrifugation différentielle et par équilibre isopycnique dans un gradient de sucrose. Afin de déterminer les conditions optimum de purification, une étude de leur stabilité en fonction de la concentration de sucrose, du pH, de la force ionique et de la température a été effectuée. Les grains sont purifiés à pH 6.0, 0.65M sucrose, 5×10-3M, Morpholine éthane acide sulfonique à 0°. Les grains zymogènes purifiés par centrifugation différentielle ont une bonne apparence morphologique mais sont légèrement contaminés par des mitochondries et des lysosomes. Après purification par équilibre isopycnique, leur morphologie est moins …
Colloque
Les grains de zymogène du pancréas de rat isolés par la méthode de Lamy et al. ont été examinés en cryodécapage. Le rôle du fixateur et du cryoprotectant a été étudié. La fraction purifiée est fixée en glutaraldéhyde 3% en paraformaldéhyde 1% en tampon MES-sucrose à pH 6.0 pendant 45 min. Après centrifugation à 5,000 rpm pendant 5 min, le culot placé dans une solution de 40% de sucrose pendant 30 min, puis congelé à -150°C au Freon 22 refroidi à l'azote liquide et fracturé sous vide dans l'appareil Balzers. Les répliques obtenues en platine-carbone subissent différentes attaques puis sont …
Colloque
Des grains zymogènes purifiés par centrifugation différentielle sont lysés lentement à pH 7.4 dans une solution 1.0M de sucrose. Cette solution est placée dans un tube de centrifuge et recouverte d'une solution 0.3M sucrose. Après une centrifugation de 30 min. à 100,000g les membranes se retrouvent à l'interface entre les deux solutions. Un examen de ces membranes au microscope électronique révèle que la plupart sont sous forme de vésicules apparemment fermées. Elles ont une activité faible et variable de cytochrome C oxydase, de phosphatase acide et de 5'-nucléotidase. Par contre, elles possèdent une activité spécifique ATPasique qui peut aller jusqu'à …
Colloque
Nous décrivons la séparation chromatographique sur colonne d'hydroxyapatite de deux zymogènes qui, après activation tryptique, hydrolysent l'élastine. Par utilisation d'un tampon acétate dont la concentration varie en gradient linéaire de 5 x 10^-3 à 0.1M on recueille deux pics principaux. Les protéines ainsi isolées sont homogènes, monocaténaires et de composition en acide aminé différentes. Leurs poids moléculaires sont compris entre 27,000 et 28,000 daltons. Chacun des zymogènes après activation trypsique présente une activité estérasique. L'un, le chymotrypsinogène B, hydrolyse l'ATEE, mais non la TAME, base du test spécifique de la procarboxypeptidase E. L'autre, la procarboxypeptidase E, hydrolyse la TAME et …
Colloque
Nous avons tenté de purifier et d'isoler électrophorétiquement les proélastases à partir d'une poudre acétonique de pancréas de porc. Notre but est de les caractériser quant à leur mobilité électrophorétique relative en gel polyacrylamide, quant à leur spécificité enzymatique et, enfin, quant à leur activation trypsique. Nous avons examiné deux techniques électrophorétiques préparatives (les électrophorèses en gradient de pH et en veine liquide) auxquelles fut soumise la préparation obtenue en fin de purification. Il nous fut possible d'isoler de la sorte au moins deux formes de proélastases: les proélastases A et B. Elles se différencient notablement par l'activité estérasique de …
