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Colloque
Le site de fixation de la streptomycine sur la sous-unité 30S du ribosome bactérien est un site complexe où plusieurs protéines sont impliquées. Nous avons utilisé une nouvelle approche expérimentale pour caractériser ce site en liant covalemment la [2,3-3H]dihydrostreptomycine à la sous-unité 30S à l'aide d'un agent pontant, le phényldiglyoxal. À l'aide des techniques de filtration sur Millipore et de centrifugation au travers d'un gradient de saccharose, nous avons montré que, dans ces conditions adéquates, il est possible de lier covalentiellement la [2,3-3H]dihydrostreptomycine à la sous-unité 30S et que cette liaison est spécifique. Après ce pontage, les protéines ribosomiques sont …
Colloque
Des mutants résistants à la néomycine (Nm) (100μg/ml) ont été sélectionnés à partir d'E.coli K12Y20, par traitement au méthanesulfonate d'éthyle. Les mutants obtenus sont des mutants doubles ou une mutation affecte le métabolisme énergétique tandis que l'autre affecte le ribosome. La mutation ribosomique est cotransductible avec le caractère aroE (elle est donc localisée dans la région str de chromosome). Elle peut aussi être séparée de la mutation affectant le métabolisme énergétique par conjugaison sur un milieu minimum. Cependant, séparée de l'autre mutation, elle se confère qu'une faible résistance à Nm (5-10 μg/ml). In vitro, dans un système de synthèse de …
Colloque
Des mutants bactériens résistants à la néomycine (100 mg/µl) ont été sélectionnés à partir d'E. coli KY1220 par traitement au méthanesulfonate d'éthyle (EMS) suivi d'un long délai phénotypique. Ces mutants ont été caractérisés in vivo : croissance sur différents milieux (succinate, malate...), réponse à divers antibiotiques (aminoglycosides, tétracyclines, chloramphénicol). Leurs ribosomes ont été isolés et caractérisés pour leur activité de synthèse in vitro en présence de divers antibiotiques, alors que des synthèses dirigées par des RNA messagers M2(+) et poly(U) ou naturels (RNA du phage MS2) et aussi par leur aptitude à engendrer des erreurs de lecture. L'ensemble des résultats …
Colloque
Nous avons comparé la stimulation d'erreurs de lecture in vitro par la streptomycine et la néomycine. Les systèmes de synthèse utilisés étaient dirigés par le polyuracile et individualisé l'acide aminé non-codé par le message (isoleucine, sérine, tyrosine, phénylalanine) et les incorporeurs. La fidélité de l'enchaînement d'acides non correspondants est altérée. La néomycine n'augmente pas le taux d'erreurs de lecture, contrairement à la streptomycine, ce qui entraîne l'obtention d'un produit de synthèse contenant 1 à 2 erreurs de lecture. Nous avons précédemment montré que la streptomycine et la néomycine perturbent la fidélité de lecture du message en augmentant les erreurs de …
Colloque
Nous avons étudié l'activité de synthèse protéique des polyribosomes de hamsters atteints de cardiomyopathie héréditaire. Des polyribosomes ont été purifiés à partir de différents tissus de hamsters cardiomyopathiques (foie, muscle squelettique, muscle cardiaque). Un test caractérisé par leur activité de synthèse protéique dans un système acellulaire où les enzymes de synthèse des e-RNAs étaient fournis par un extrait de germe de blé. L'activité de synthèse était mesurée d'après l'incorporation de [14C] leucine dans une polypeptide que l'on précipite à l'acide trichloracétique. Nous avons observé une diminution de l'activité de synthèse des polyribosomes de hamsters cardiomyopathiques dans les différents types de …
Colloque
Nous avons comparé la sensibilité à différents inhibiteurs de la synthèse protéique (émétine et pactamycine) de cellules transformées (SV-72) et non-transformées (3T3). Nos méthodes d'étude ont consisté à mesurer la synthèse protéique in vivo et in vitro d'après l'incorporation dans des protéines, de [14C] leucine. L'incorporation in vitro est évaluée dans un système où seules les polysomes provenant de cellules étudiées tandis que l'acceptor tRNA et les autres fournit par un extrait de foie de lapin. Nous avons observé que les cellules transformées SV-72 sont plus sensibles à l'émétine et à la pactamycine que les cellules 3T3. L'étude des inhibiteurs …
Colloque
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique résultant d'une mutation au niveau du chromosome X. Nous avons isolé des polyribosomes de fibroblastes en culture de porteurs et de patientes atteintes de la DMD et de porteuses de la maladie. Après broyage et homogénéisation, les cellules ont été centrifugées, les polyribosomes ont été isolés par centrifugation à travers un coussin de saccharose 1,5M. Un test caractéristique pour leur activité in vitro a été effectué. Les résultats obtenus sur les fractions solubles sont fournis par un test d'activité de bille. Les résultats obtenus montrent que chez les 7 patients …
Colloque
Nous avons étudié les changements de conformation du ribosome bactérien provoqués par la streptomycine (Sm) et la néomycine (Nm), à l'aide de sondes nucléaires: des marqueurs de protéines (la N- [14C]-éthylmaléimide, un analogue de spin et un marqueur fluorescent analogue à la N-éthylmaléimide) et un marqueur du RNA (le bromure d'éthidium). Nos résultats montrent que Sm et Nm modifient la structure du RNA et des protéines ribosomiques. La localisation des changements diffère suivant l'antibiotique étudié: Sm affecte principalement le RNA, tandis que Nm affecte surtout les protéines ribosomiques. La Sm déplace l'anticodon de l'ARNt en position A, ce qui empêche …
Colloque
Des ribosomes d'E.coli ont été marqués avec des marqueurs radioactifs ou fluorescents, ou des marqueurs de spin, dérivés de la N-éthylmaléimide. La néomycine induque que, en présence de néomycine (Nm), la structure du ribosome est déformée et que certaines protéines adoptent une structure plus déployée. Le marquage du RNA ribosomique avec du bromure d'éthidium indique également qu'en présence de Nm le RNA adopte une conformation plus déployée. En présence de néomycine, la structure provoquée par ce type de déformation du ribosome observée par Ne est analogue à celui qui a été observé avec la streptomycine (Sm), lors de travaux antérieurs …
Colloque
La fréquence d'obtention des mutants ribosomiques résistants à la streptomycine (Sm^r) est faible et le nombre de types "classiques" de mutants Sm^r est limité à 4. Toutefois, nous avons montré qu'il est possible d'accroître la fréquence et le nombre de types de mutants Sm^r par traitement avec un agent mutagène suivi d'un long délai phénotypique (7h). La fréquence de mutants varie proportionnellement à la concentration en agent mutagène lorsque le délai phénotypique est court (2.5h); les mutants Sm^r ainsi sélectionnés sont de type classique caractérisé par un changement dans la protéine ribosomique S12. Par contre, la fréquence de mutants varie …
